Rządowy projekt ustawy o odpadach

h) o wietlenie zapewniające stałe białe jarzeniowe wiatło (2 150-4 300 luksów),
i) ezy lub inne narzędzia używane do przenoszenia rzęsy.
j) 250 cm3 szklane zlewki lub kolbki Erlenmayera (do ć duże, aby zmie cić 150 cm3 roztworu
testowego i kolonie rzęsy); uwaga: wszystkie naczynia powinny być tego samego typu i wielko ci;
k) aparatura do pomiarów fizykochemicznych testowanych substancji chemicznych lub ich mieszanin.

2. Wybór i przygotowanie organizmów testowych
2.1. Charakterystyka organizmu testowego
Drobna ro lina wodna o płaskich, bezlistnych kolistych pędach lub odwrotnie jajowatych rednicy 2-3
mm złożonych z czę ci tzw. połci z korzonkami. Rzadko spotykane - kwiaty jednopłciowe bez okwiatu;
męski z jednego pręcika, żeński z jednego słupka.
2.2. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego
Rzęsa wodna Lemna minor może być uzyskana ze źródeł komercyjnych, laboratoriów badawczych
lub
z terenu naturalnego. Organizm musi być bezbłędnie zidentyfikowany i zatwierdzony
taksonomicznie przed użyciem. Innym, preferownym przez niektórych biologów gatunkiem rzęsy jest
L. gibba, L. perpusilla, L. pencicostata, L. polyrrhiza, które mogą być używane z sukcesem po
modyfikacjach procedury.
2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych
2.3.1. Hodowla organizmów testowych
rodowisko wzrostu ro lin w warunkach kontrolnych powinno być prowadzone w odpowiednich
pomieszczeniach lub na zamkniętych obszarach umożliwiających utrzymanie odpowiedniej ilo ci
pojemników testowych.
Należy aklimatyzować nową hodowlę rzęsy do otoczenia testowego co najmniej przez 2 tygodnie
przed rozpoczęciem badań. Ta hodowla ro nie energicznie i zapewnia prawie niewyczerpany zapas
dla testów prowadzonych w odpowiednich warunkach. Hodowla uzyskana z jednej wyizolowanej
ro liny powinna posłużyć do zaszczepienia wszystkich kolb użytych w opisywanym te cie.
Aby przygotować 10 dm3 roztworu do hodowli, należy dodać 100 cm3 każdego roztworu
podstawowego składników pokarmowych A, B i C (tabela 1) do demineralizowanej lub innej
odpowiedniej wody (np. wody destylowanej). Dodać rozcieńczony (1/4 mocy) roztwór do hodowli raz
w tygodniu. Głęboko ć wody powinna wynosić co najmniej 40 mm.
Raz w miesiącu przenie ć zapasową hodowlę do wieżo przygotowanego roztworu składników
odżywczych.
2.3.2. Uzyskiwanie i przygotowanie organizmów do testów
Szczepy hodowlane powinny być rozmnażane w akwariach przez okres dwóch tygodni (z koniecznym
przerzedzaniem) przed użyciem w te cie. Ro liny użyte w te cie powinny być okresowo
selekcjonowane z akwariów hodowlanych. Zaszczepienie powinno być wykonane ro linami
pochodzącymi z hodowli młodszych niż dwutygodniowe.
2.3.3. Selekcja organizmów do testów
Wybrać okazy rzęsy z hodowli, które rosły w tych samych warunkach. Uciąć wszystkie korzenie, by
zredukować skażenie glonami, je li jest taka konieczno ć. Należy posegregować ro linki o podobnej
wielko ci, a liczba ro linek i listków powinna być taka sama lub możliwie taka sama w każdym
naczyniu. Używać jedynie zdrowych ro lin zawierających dwa li cie o takich samych lub podobnych
rozmiarach. Alternatywnie 4 ro liny 3-listne lub 3 ro liny 4-listne. Zalecane jest, by w każdym naczyniu
znalazło się co najmniej 12, ale nie więcej niż 16 listków. Ro linki są eksponowane w zamkniętych
naczyniach na równe objęto ci każdego rozcieńczenia badanej próbki na okres 7 dni.
2.3.4. Choroby i drapieżniki
Choroby, ro linożerne owady lub inne szkodniki zwykle nie sprawiają problemów w hodowlach rzęsy.
Jeżeli w hodowli wystąpią jakiekolwiek zmiany chorobowe, należy ją zniszczyć i rozpocząć nową.
Wskazane jest utrzymywanie kilku hodowli izolowanych od siebie.
2.3.5. Woda do hodowli (pożywka) i do przygotowania roztworów potrzebnych do analizy
Woda do rozcieńczeń i woda do prób kontrolnych jest identyczna z roztworem substancji odżywczych
do hodowli rzęsy. Ten roztwór należy przygotować według tabel nr 1 i nr 2.


15
Tabela nr 1
Odczynnik
Stężenie
Roztwór A
NaNO3
25,5 g/dm3
NaHCO3
15,0 g/dm3
K2HPO4
1,04 g/dm3
Roztwór B
CaCl2*2H2O
4,41 g/dm3
MgCl2
5,7 g/dm3
FeCl3
0,096 g/dm3
Na2EDTA*2H2O
0,3 g/dm3
MnCl2
0,264 g/dm3
Roztwór C
MgSO4*7H2O
14,7 g/dm3
H3BO3
0,186 g/dm3
Na2Mo04*2H20
7,26 mg/dm3
ZnCl2
3,27 mg/dm3
CoCl2
0,78 mg/dm3
CuCl2
0,009 mg/dm3


Tabela nr 2

Pierwiastek
Stężenie końcowe

Roztwór A

N
42,0 mg/dm3

Na
110,0 mg/dm3

C
21,4 mg/dm3

K
4,69 mg/dm3

P
1,86 mg/dm3

Roztwór B

Ca
12,0 mg/dm3

Mg
29,0 mg/dm3

Fe
0,33 mg/dm3

Mn
1,15 mg/dm3

Roztwór C

S
19,1 mg/dm3

B
325 µg/dm3

Mo
28,8 µg/dm3

Zn
15,7 µg/dm3

Co
3,54 µg/dm3

Cu
0,04 µg/dm3

Uwagi:
Do przygotowania pożywki dodać 1 cm3 każdego roztworu do 100 cm3 dejonizowanej wody. Ustalić
pH na poziomie 7,5-8,0.

16
Aby przygotować 10 dm3 roztworu do hodowli, dodać 100 cm3 każdego roztworu podstawowego
składników pokarmowych A, B i C (tabela nr 1) do demineralizowanej lub innej odpowiedniej wody (np.
wody destylowanej).
Pożywka powinna zostać zrobiona przed każdym transferem kultur rzęsy i do przygotowania nowych
roztworów podczas prowadzenia testów. Jeżeli jest przygotowywana z wyprzedzeniem, powinna być
trzymana w lodówce.
2.3.6. O wietlenie
Należy zapewnić stałe chłodne, białe jarzeniowe wiatło (2 150-4 300 luksów) na powierzchni wody.
Natężenie wiatła powinno być mierzone w całym obszarze inkubacji i nie powinno się różnić więcej
niż 15 % od wybranego natężenia wiatła.
2.3.7. Temperatura
Hodowlę należy prowadzić w pomieszczeniu o czystym powietrzu, w którym utrzymywana będzie
temperatura 25±2 °C.
2.3.8. Naczynia do hodowli
Należy hodować rzęsę w 15 l naczyniu, np. akwarium lub nierdzewnej stalowej misce:
a) po założeniu hodowli należy każde naczynie czy cić czystą gąbką w celu usunięcia martwej rzęsy
i płukać destylowaną lub demineralizowaną wodą.
b) raz w miesiącu, podczas wymiany wody, należy umyć każde naczynie wodnym roztworem
detergentu; po umyciu dokładnie wypłukać 3 razy wodą wodociągową, a następnie wodą do hodowli
w celu usunięcia resztek detergentu,
c) ezy lub inne narzędzie używane do przenoszenia rzęsy powinny zostać usunięte po użyciu lub
starannie umyte i wysterylizowane przed ponownym użyciem.
3. Metodyka wykonania testu
3.1. Wytyczne ogólne
W testach przesiewowych należy użyć ustalonych z góry rozcieńczeń do ustalenia, czy próbka jest
toksyczna w porównaniu z roztworem kontrolnym; jeżeli próbka jest toksyczna, należy wykonać test
wstępny, który ma na celu ustalenie rzędu toksyczno ci badanych wyciągów wodnych odpadów.
Naczynia używane w testach to 250 cm3 szklane zlewki lub kolbki Erlenmeyera, do ć duże, by
zmie cić 150 cm3 roztworu testowego i kolonie rzęsy, bez stłoczenia w czasie trwania testu; wszystkie
naczynia powinny być tego samego typu i wielko ci; pomimo że wykonuje się co najmniej 3
powtórzenia, czasami mogą być konieczne większe naczynia, by pomie cić dodatkowe kolonie
i objęto ci badanych roztworów; stosunek objęto ci badanego roztworu do objęto ci naczynia nie
powinien przekroczyć 2:5; dla każdego badanego rozcieńczenia i kontroli należy wykonać tyle samo
powtórzeń. Warunki rodowiskowe powinny odpowiadać tym, jakie panują podczas hodowli
organizmów testowych (ust. 2).
3.2. Test wstępny
Test ten powinien być przeprowadzany w celu ustalenia, czy test ostateczny jest potrzebny, i po to,
aby okre lić rozcieńczenie roztworów dla testu ostatecznego. W testach ustalania rzędu toksyczno ci
wykonuje się próby wstępne, sporządzając szereg rozcieńczeń badanych wyciągów wodnych
z zastosowaniem ilorazu postępu geometrycznego równego 10, np. 10 %, 1 %, 0,1 %.
Jeżeli test wstępny pokazał, że najniższe rozcieńczenie wyciągu wodnego z badanej próbki odpadu
nie wpłynęło niekorzystnie na rzęsę, oznacza to, że wyciąg wodny badanego odpadu nie jest
fitotoksyczny.
3.3. Test wła ciwy
Celem tego testu jest okre lenie NER5, NER50, NER90, LID, S20 dla wzrostu rzęsy, bazując na
okre leniu całkowitej liczby listków, tempie wzrostu i/lub miertelno ci listków.
3.3.1. Metodyka wykonania testu:
a) do testu należy przygotować, na bazie uzyskanych wyników z testu wstępnego, 5 rozcieńczeń
próbki wyciągu wodnego (nie licząc kontroli) o malejącym rozcieńczeniu, przy zastosowaniu ilorazu
postępu geometrycznego rozcieńczeń od 0,5 do 2,0, np. 10 %, 5 %, 2,5 %:
- zakres rozcieńczeń badanego wyciągu powinien być dobrany tak, aby w najmniejszym rozcieńczeniu
miało to wpływ na co najmniej 90 % listków rzęsy wodnej, a w najwyższym na nie więcej niż 5 %
listków, w porównaniu z kontrolami,

17
- zakres rozcieńczeń powinien zostać dobrany tak, aby można było wykre lić krzywą odpowiedzi na
rozcieńczenia, pomiędzy NER5 a NER90,
b) dla każdego rozcieńczenia i kontroli powinny być wykonane co najmniej 3 powtórzenia, każde
zawierające 150 cm3 badanego roztworu lub tyle, by wystarczyło do uzyskania wyniku przy stosunku
wielko ci naczyń 2:5; można zastosować mniej powtórzeń zawierających większą liczbę kolonii, ale
pojemniki testowe i objęto ci roztworów muszą zostać odpowiednio przystosowane,
c) wprowadzić kontrolę negatywną zawierającą jedynie roztwór substancji pokarmowych lub
zmodyfikowany roztwór,
d) pożywka i badane roztwory czasem muszą być wymieniane w 3. lub 5. dniu prowadzenia testu lub
je li zaistnieje taka potrzeba czę ciej, by zapobiec brakom substancji odżywczych lub wyczerpaniu
badanej substancji chemicznej; okresowe odnowienie pomoże zachować stałe ekspozycyjne stężenia
badanej substancji przez czas trwania testu dla składników, które są niestabilne w wodzie.
3.3.2. Wyniki testu:
a) najpowszechniej używaną i pozornie wiarygodną metodą oceniania jest wzrost listków; aby
zmierzyć wzrost listków, należy policzyć każdy dostrzegalny sterczący pączek, podczas oglądania pod
ręcznym obiektywem lub sekcyjnym mikroskopem; ta nieniszcząca metoda zezwala na powtarzanie
obserwacji tego samego roztworu; obserwacje wyglądu i liczby listków należy wykonywać w dniach 0.,
3., 5. i 7.; w dniu 7. okre lana jest całkowita liczba żywych i/lub martwych listków; mikroskop sekcyjny
ułatwi obserwacje; należy wykre lić krzywe odpowiedzi na stężenia; krzywe odpowiedzi na stężenie
są kre lone dla całkowitej liczby listków, tempa wzrostu (jako liczba listków na dzień) i miertelno ci
(procent martwych listków); te krzywe mogą stanowić podstawę do okre lania NER5, NER50, NER90,
LID, S20; należy zapisać jakiekolwiek zmiany w rozwoju lub wyglądzie listków, takie jak:
- wzrost ich ilo ci (listek jest liczony bez względu na rozmiar)
- zmniejszenie się rozmiaru
- chlorozę (utratę pigmentu/żółknięcie)
- nekrozy (martwe miejsca)
- zniszczenie korzenia
- utratę pływalno ci
- wypukło ci (w kształcie łuku lub opuchlizna)
- tonięcie listków
- rozpad kolonii
porównanie chorych listków z okazami w próbie kontrolnej posłuży do ustalenia LID (rozcieńczenia
niewywołującego zauważalnego efektu),
b) inne metody, które mogą być oszacowane w tym te cie i które wskazałyby na inhibicję wzrostu:
- pobór węgla C14
- zawarto ć chlorofilu a, b, c
- zawarto ć biomasy
- powierzchnia listków
- liczba kolonii, liczba korzeni
- długo ć korzeni,
c) powinny być też zapisane każde dodatkowe obserwacje, takie jak sedymentacja roztworu
testowego lub inne anomalia,
d) niektóre substancje zawarte w wyciągu wodnym raczej stymulują, niż inhibitują wzrost rzęsy;
zanotować taki efekt, jeżeli występuje.
4. Obliczenie wyników oznaczenia
4.1. W testach przesiewowych kluczowym pytaniem jest, czy próbka jest toksyczna, czy stymulująca
w porównaniu z próbą kontrolną.
4.2. Toksyczno ć (lub stymulację) należy okre lić jako procent inhibicji (lub stymulacji) w odniesieniu
do kontroli:
% l = 100 · (Lk-Lt)/Lk, gdzie:
Lk i Lt są rednimi długo ciami korzeni odpowiednio w kontroli i próbie testowej; otrzymane wyniki
służą do obliczenia NER5, NER50, NER90, LID.

18
4.3. Wyniki badań rozstrzygających mogą być zobrazowane przy użyciu liniowych, półlogarytmicznych
lub logarytmicznych wykresów. Typowa relacja rozcieńczenie-efekt jest esowata.
4.4. Należy okre lić NER5, NER50, NER90, LID oraz warto ć S20 (rozcieńczenie powodujące 20 %
efekt stymulacji) za pomocą metody statystycznej lub graficznej; nachylenie zależno ci rozcieńczenie-
reakcja jest specyficzne dla danego odpadu i dlatego może być cenną informacją.
5. Kontrola jako ci
Negatywna próbka kontrolna jest konieczna do kontroli jako ci. Test jest nie do zaakceptowania, jeżeli
więcej niż 10 % kontrolnych osobników umrze lub okaże niekorzystne symptomy. W normalnych
warunkach czas podwojenia się dla rzęsy wynosi mniej niż 2 doby. Jeżeli próbka kontrolna wykazuje
mniej niż dwukrotny wzrost listków w 96 godzin, test jest nie do przyjęcia.

Załącznik nr 3

ST
ENIA SKŁADNIKÓW
Stężenie, dla którego uznaje
Lp. Substancje
się że odpad nie posiada
składników
1
Jedna lub więcej substancji wysoce toksycznych [1]
łączne stężenia - poniżej 0,1 %
2
Jedna lub więcej substancji toksycznych [1]
łączne stężenia - poniżej 3 %
3
Jedna lub więcej substancji szkodliwych [1]
łączne stężenia - poniżej 25 %
4
Jedna lub więcej substancji żrących okre lonych jako R35 łączne stężenia - poniżej 1 %
[1]
5
Jedna lub więcej substancji żrących okre lonych jako R34 łączne stężenia - poniżej 5 %
[1]
6
Jedna lub więcej substancji drażniących okre lonych jako łączne stężenia - poniżej 10 %
R41 [1]
7
Jedna lub więcej substancji drażniących okre lonych jako łączne stężenia - poniżej 20 %
R36, R37 i R38 [1]
8
Jedna substancja rakotwórcza kategorii 1 lub 2 [1]
stężenie - poniżej 0,1 %
9
Jedna substancja rakotwórcza kategorii 3 [1]
stężenie - poniżej 1 %
10
Jedna substancja szkodliwa na rozrodczo ć kategorii 1 lub 2 stężenie - poniżej 0,5 %
okre lona jako R60, R61 [1]
11 Jedna substancja szkodliwa na rozrodczo ć kategorii 3 stężenie - poniżej 5 %
okre lona jako R62, R63 [1]
12 Jedna substancja mutagenna kategorii 1 lub 2 okre lona stężenie - poniżej 0,1 %
jako R46 [1]
13
Jedna substancja mutagenna kategorii 3 okre lona jako R40 stężenie - poniżej 1 %
[1]


Obja nienie:
[1] Okre lone na podstawie rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) Nr 1272/2008 z
dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin,
zmieniające i uchylające dyrektywy 67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniające rozporządzenie (WE)
nr 1907/2006




19