Rządowy projekt ustawy o odpadach

Naczynia do hodowli i szkło laboratoryjne należy myć wodnym roztworem detergentu, a następnie
dokładnie płukać i sterylizować.
1.5. Zasada metody
Oznaczenie aktywno ci cytotoksyczno ci na rzeżusze ogrodowej Lepidium sativum L. polega na
obserwacji reakcji organizmów testowych umieszczonych w badanych wyciągach wodnych odpadów.
W etapie pierwszym okre lanym jako test wstępny ustalany jest rząd toksyczno ci wykorzystywany
w
etapie drugim zwanym testem wła ciwym, na podstawie którego okre lane są warto ci
następujących parametrów: NER5, NER50, NER90, LID.
1.6. Odczynniki i roztwory:
a) woda destylowana lub zdemineralizowana,
b) wodny roztwór detergentu,
c) salicylan sodowy,
d) siarczan cynkowy,
e) fenol,
f) czerwień rutenowa (lub czerwień obojętna).
1.7. Aparatura i przyrządy:
a) urządzenia laboratoryjne do mieszania i rozcieńczania pożywki,
b) źródło wody demineralizowanej lub destylowanej,
c) autoklaw,
d) pH-metr,
e) lupa binokularowa z przyrządem mikrometrycznym o dokładno ci 0,1 mm,
f) termostat,
g) ezy lub inne narzędzia używane do przenoszenia nasion rzeżuchy,
h) naczynia z czystego szkła lub plastiku (najlepsze naczynie to szalka Petriego o rednicy 10 cm).
2. Wybór i przygotowanie organizmów testowych
2.1. Charakterystyka organizmu testowego
Ro lina o wysoko ci 30-60 cm, naga, posiada białe kwiaty. Łuszczynki szeroko oskrzydlone,
opatrzone bardzo krótką szyjką, nieprzewyższającą wycięcia szczytowego łuszczynki.
2.2. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego
Nasiona rzeżuchy ogrodowej Lepidium sativum L. lub ro lina mogą być uzyskane ze źródeł
komercyjnych lub laboratoriów badawczych. Organizm testowy musi być bezbłędnie zidentyfikowany
i zatwierdzony taksonomicznie przed użyciem.
2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych
2.3.1. Uzyskiwanie i przygotowanie organizmów do testów
Nasiona rzeżuchy należy wysiać na bibułę zwilżoną wodą destylowaną lub wodą zdemineralizowana.
Inkubować w cieplarce w temperaturze 25±0,5 °C przez 17-24 h.
2.3.2. Selekcja organizmów do testów
Do badań stosowane są tylko te organizmy w ilo ci 25 sztuk na jedno stężenie, u których wzrost
korzeni po 17-24 h kiełkowania wynosi około 1 mm.
2.3.3. Woda do przygotowania roztworów potrzebnych do analizy
Do przygotowania roztworów do analizy wykorzystywana jest woda destylowana
(zdemineralizowana).
2.3.4. O wietlenie
Podczas inkubacji i w czasie trwania testu wskazany jest brak o wietlenia.
2.3.5. Temperatura
Podczas inkubacji i w czasie trwania testu wskazane jest utrzymywanie temperatury na poziomie
25+0,5 °C.
3. Metodyka wykonania testu
3.1. Wytyczne ogólne
W testach przesiewowych należy użyć ustalonych z góry stężeń, by ustalić, czy próbka jest toksyczna
w porównaniu z roztworem kontrolnym; jeżeli próbka jest toksyczna, należy wykonać test wstępny,
który ma na celu ustalenie rzędu toksyczno ci badanych wyciągów wodnych odpadów.

10
Do testu należy używać naczyń z czystego szkła lub tworzywa sztucznego; najlepszym naczyniem jest
szalka Petriego o rednicy 10 cm; przed użyciem każde naczynie należy dokładnie umyć wodnym
roztworem detergentu, a następnie dokładnie 3 razy płukać wodą wodociągową, 1 raz wodą
destylowaną; ezy lub inne narzędzie używane do przenoszenia nasion rzeżuchy powinny zostać
usunięte po użyciu lub starannie umyte i wysterylizowane przed ponownym użyciem.
Parametry testu - warunki rodowiskowe powinny odpowiadać tym, jakie panują podczas
przygotowania organizmów testowych (ust. 2).
Utrwalanie i wybawianie strefy korzeniowej - po inkubacji w celu utrwalenia badanego materiału
skiełkowane nasiona rzeżuchy należy przenie ć do utrwalacza o następującym składzie:
- salicylan sodowy - 2,0 g
- siarczan cynkowy - 2,0 g
- fenol - 0,5 g
- woda destylowana - 100,00 cm3
czas utrwalania wynosi 1/2 godziny lub dłużej; po tym czasie kiełki należy przemyć w wodzie,
a następnie włożyć do roztworu czerwieni rutenowej w stosunku 1:5 000 na szkiełku przedmiotowym,
w celu wybarwienia strefy korzeniowej; do wybarwienia może być również zastosowana czerwień
obojętna, ale daje gorsze rezultaty. Pomiarów długo ci korzeni dokonuje się pod lupą binokularową
przy użyciu przyrządu mikrometrycznego z dokładno cią do 0,1 mm.
3.2. Test wstępny
Test ten powinien być przeprowadzany w celu ustalenia, czy test ostateczny jest potrzebny, i po to,
aby okre lić rozcieńczenie roztworów dla testu ostatecznego. W testach ustalania rzędu toksyczno ci
wykonuje się próby wstępne, sporządzając szereg rozcieńczeń badanych wyciągów wodnych
z zastosowaniem ilorazu postępu geometrycznego równego 5.
3.3. Test wła ciwy
Celem tego testu jest okre lenie NER5, NER50, NER90, LID dla wzrostu korzenia rzeżuchy.
3.3.1. Metodyka wykonania testu:
a) do testu należy przygotować, na bazie uzyskanych wyników z testu wstępnego, 5 rozcieńczeń
próbki (nie licząc kontroli) o malejącym rozcieńczeniu, przy zastosowaniu ilorazu postępu
geometrycznego rozcieńczeń od 0,5 do 2,0; w analizie uwzględnia się te rozcieńczenia wyciągu
wodnego, które w sposób statystycznie istotny (L = 0,05) hamują wzrost (wydłużenie się) korzeni
w stosunku do prób kontrolnych; (najlepiej przygotować serię rozcieńczeń, w których rodkowe
powoduje około 50 % inhibicję wzrostu, a najniższe i najwyższe skutkują około 90 i 10 % efektem
inhibicji),
b) dla każdego rozcieńczenia i kontroli powinny być wykonane co najmniej 3 powtórzenia, każde
zawierające 10 cm3 badanego roztworu,
c) wprowadzić kontrolę negatywną zawierającą jedynie wodę lub 1 % metylocelulozę.
3.3.2. Wyniki testu
Pod wpływem związków cytotoksycznych występuje inhibicja procesów podziałowych komórek
merystomatycznych, co prowadzi do zahamowania wzrostu organów rzeżuchy ogrodowej Lepidium
sativum L. W te cie bierze się pod uwagę długo ć korzeni badanego organizmu. Jeżeli w wysokich
rozcieńczeniach występuje stymulacja, a nie inhibicja wzrostu rzeżuchy, należy zanotować to
zjawisko, jeżeli ma miejsce.
4. Obliczanie wyników oznaczenia
4.1. W testach przesiewowych kluczowym pytaniem jest, czy próbka jest toksyczna, czy stymulująca
w porównaniu z próbą kontrolną.
4.2. Toksyczno ć (lub stymulację) należy okre lić jako procent inhibicji (lub stymulacji) w odniesieniu
do kontroli:
% l = 100 · (Lk-Lt)/Lk, gdzie:
Lk i Lt są rednimi długo ciami korzeni odpowiednio w kontroli i próbie testowej; otrzymane wyniki
służą do obliczenia NER5, NER50, NER90, LID.
4.3. Między logarytmami rozcieńczeń związków i efektem działania występuje w przybliżeniu rozkład
normalny, do obliczeń stosuje się przybliżoną metodą statystyczną wg Kadłubowskiego; wyniki

11
dzielone są na dwie grupy o inhibicji mniejszej i większej od 50 %, po czym obliczane są rednie dla
tych grup.
4.4. Należy okre lić NER5, NER50, NER90, LID oraz warto ć S20 za pomocą metody statystycznej
lub graficznej; nachylenie zależno ci rozcieńczenie-reakcja jest specyficzne dla danego odpadu
i dlatego może być cenną informacją.
5. Kontrola jako ci
Negatywna próbka kontrolna jest konieczna do kontroli jako ci. Test jest nie do zaakceptowania, jeżeli
więcej niż 10 % kontrolnych osobników wykazuje zmiany patologiczne.
[8] Dla odpadów, co do których istnieje podejrzenie, że zawierają czynniki zakaźne, należy wytypować
mikroorganizmy wskaźnikowe reprezentujące grupę organizmów odpowiedzialnych za tę wła ciwo ć
odpadów. W badaniach tych zaleca się, zgodnie z wybraną grupą wskaźnikową, wykorzystanie testów
dotyczących jako ciowej analizy bakterii. Decyzja o wyborze grupy poszukiwanych drobnoustrojów
powinna być podejmowana z udziałem laboratorium rekomendującego się do wiadczeniem
w mikrobiologicznych badaniach rodowiskowych.
[9] Podstawowy jest test z rozwielitkami.
[10] Wykonanie wg następującego opisu metody - Badanie wpływu na rozród rozwielitek (Daphnia
magna)
1. Wstęp
1.1. Cel
Celem badania jest okre lenie wpływu wyciągu wodnego badanych odpadów na rozród rozwielitek
(Daphnia magna).
1.2. Zasada metody
Rozwielitki umieszcza się w wyciągu wodnym badanego odpadu w różnych rozcieńczeniach.
Notowana jest liczba urodzonych osobników w przeliczeniu na jedną samicę, która przeżyta kontakt
z badaną próbką. Tę liczbę następnie porównuje się z potencjałem rozrodczym rozwielitek z próbek
kontrolnych.
2. Charakterystyka organizmu testowego
Dafnie sp. są małymi słodkowodnymi skorupiakami o ciele spłaszczonym bocznie, okrytym,
z wyjątkiem głowy, przezroczystym pancerzem, zakończonym kolcem. Na głowie znajdują się ciemno
pigmentowane, ruchliwe oko oraz krótkie czułki pełniące funkcję lokomotoryczną. Dzięki
przezroczysto ci pancerza widoczne są niektóre narządy wewnętrzne.
2.1. Uzyskiwanie i wybór organizmu testowego
Daphnia sp. może być uzyskana ze źródeł komercyjnych, laboratoriów badawczych lub z terenu
naturalnego. Od 20 do 30 rozwielitek wystarczy do założenia hodowli. Organizm musi być bezbłędnie
zidentyfikowany i zatwierdzony taksonomicznie przed użyciem.
2.2. Okre lenia
a) NER - najwyższe rozcieńczenie wodnego wyciągu z odpadu, które działa szkodliwie na
rozrodczo ć,
b) LID (Lowest lneffective Dilution) - najmniejsze nieefektywne rozcieńczenie.
2.3. Laboratoryjna hodowla organizmów testowych
Hodowle należy prowadzić zgodnie z metodyką zawartą w rozdz. C.2 załącznika (patrz: obja nienia
w odno niku 1 pkt a).
2.4. Pokarm i sposób karmienia organizmów testowych
Rozwielitki należy karmić mieszaniną zielonych glonów i drożdżami. Najlepiej, je li w skład glonów
wchodzić będą Selenastrum capricornutum, Scenedesmus subspicatus i ewentualnie Chlorella sp.
2.4.1. Mieszanina glonów z drożdżami; aby przygotować mieszaninę glonów, należy je odwirować,
przepłukać w przefiltrowanej wodzie ze zbiornika naturalnego (wodę przepu cić przez filtr 0,22 m)
lub w przefiltrowanej pożywce, na której rosną glony, i ponownie odwirować; należy pamiętać, że
podawanie pokarmu w nadmiarze może powodować wyczerpywanie się tlenu, a następnie mierć
organizmów;
rozwielitki należy karmić, używając sterylnej pipety Pasteura, dodając:
- do organizmów 9 do 10 dni - 2 krople każdych glonów i drożdży,
- do organizmów 9- ÷ 10-dniowych - 1 kroplę każdych glonów i drożdży,

12
na dwa dorosłe osobniki, zaokrąglając, jeżeli jest nieparzysta ilo ć rozwielitek; na koniec tygodnia
pracy (np. w piątek) dodać 1 dodatkową kroplę każdych glonów i drożdży na każdą zlewkę z hodowlą;
jeżeli tylko 2 z 3 gatunków glonów są wykorzystywane do karmienia, należy dodać proporcjonalnie
więcej z tych 2 glonów.
2.4.2. Karmienie jednym gatunkiem glonów; 7-dniowa hodowla glonów np. Selenastrum capricornutum
powinna zawierać 4-5 mln komórek w 1 cm3; należy zmieszać 7-dniową hodowlę glonów z hodowlą 3-
dniową w stosunku objęto ciowym 2:1; wirować komórki glonów, a następnie zawiesić je w wodzie
wodociągowej rednio twardej lub twardej tak, aby w 1 cm3 było w przybliżeniu 10 mln komórek;
dziennie należy dostarczyć rozwielitkom w przybliżeniu 300 000 komórek glonów na 1 cm3 hodowli,
czyli dodać ok. 30 cm3 zawiesiny komórek do 1 dm3 hodowli.
3. Metodyka wykonania testu
3.1. Test trwa 21 dni, czyli 5 wylęgów.
3.2. Liczba zwierząt używanych do badania wynosi 60 sztuk.
3.3. Osobniki umieszcza się pojedynczo w 100 cm3 zlewce z 60-80 cm3 testowanego roztworu;
wykonuje się 10 powtórzeń dla pięciu testowanych stężeń oraz 10 prób kontrolnych; co 2 lub 3 dni
należy policzyć osobniki, które przeżyły, i nowo narodzone; potem dorosłe osobniki przenosi się do
wieżego roztworu testowanej substancji, a młode usuwa się.
4. Obliczanie wyników oznaczenia
Danych uzyskanych w wyniku badania reprodukcji używa się do okre lenia największego
rozcieńczenia wyciągu wodnego odpadu potrzebnego do wywołania szkodliwego efektu (NER) oraz
najmniejszego rozcieńczenia niepowodującego możliwego do zaobserwowania efektu (LID).
Porównuje się liczbę urodzonych osobników w przeliczeniu na samicę, która przeżyła kontakt
z testowaną substancją, z potencjałem rozrodczym osobników użytych do badania kontrolnego.
[11] Podstawowe testy przesiewowe należy wykonać na bakteriach, liniach komórkowych ssaków lub
komórkach drożdży. Model badawczy powinien składać się z dwóch testów, tj. jednego na komórkach
prokariotycznych i jednego na komórkach eukariotycznych.
[12] Należy wykonać testy na bakteriach, na formach młodocianych bezkręgowców i glonów (zestawy
komercyjne), oraz na żywych organizmach ro linnych Lemna minor i zwierzęcych, takich jak Daphnia
sp., ryby. Model badawczy powinien składać się z testów dla organizmów na różnych poziomach
troficznych.
[13] Wykonanie wg następującego opisu metody - Oznaczenie toksyczno ci ostrej na rzęsie wodnej
Lemna minor.
1. Wstęp
1.1. Cel
Celem badania jest okre lenie wysoko ci stężeń toksycznych wyciągu wodnego badanych odpadów
na rzęsie wodnej Lemna minor.
1.2. Zakres stosowania metody
Metodę należy stosować do badania fitotoksyczno ci badanych odpadów na rzęsie, która jest
idealnym organizmem do tego typu badania. Ponieważ większo ć wyciągów wodnych jest barwnych
i/lub mętnych, przez co sprawiają trudno ci w badaniu toksyczno ci z użyciem glonów bez
uprzedniego przesączenia, które obniża integralno ć próbki. W dodatku niektóre próbki zawierają
labilne składniki i wymagają metod odnawialnych lub przepływowych. Testy na glonach mogą być
nieodpowiednie do takich próbek, podczas gdy toksyczno ć badana na rzęsie może być łatwo
modyfikowana innymi metodami.
Test toksyczno ci na rzęsie wodnej jest przydatny, szczególnie do okre lania fitotoksyczno ci na
powierzchni rozdziału powietrze-woda, gdzie substancje powierzchniowo czynne, oleje i tłuszcze oraz
toksyczne organiczne związki mogą się gromadzić. Test ten jest też użyteczny do okre lania
toksyczno ci metali, związków organicznych, cieków przemysłowych i miejskich. Ogólnie jest
okre lany jako prosty, czuły i wydajny test.
1.3. Okre lenia:
a) toksyczno ć ostra - obejmuje szkodliwe skutki występujące w okre lonym czasie po podaniu
pojedynczej dawki wyciągu,

13
b) widoczna toksyczno ć - ogólne okre lenie opisujące wyraźne objawy toksyczno ci; powinny one
być wystarczające do oszacowania zagrożenia i powinny być takie, by można było oczekiwać, że
obniżenie rozcieńczenia spowoduje zmiany intensywno ci objawów toksyczno ci i prawdopodobnie
miertelno ć,
c) NER5 - najwyższe rozcieńczenie wodnego wyciągu z odpadu, który hamuje wydłużenie się korzeni
o 5 % w stosunku do kontroli,
d) NER50 - najwyższe rozcieńczenie wodnego wyciągu z odpadu, który hamuje wydłużenie się
korzeni o 50 % w stosunku do kontroli,
e) NER90 - najwyższe rozcieńczenie wodnego wyciągu z odpadu, który hamuje wydłużenie się
korzeni o 90 % w stosunku do kontroli,
f) LID (Lowest lneffective Dilution) - najmniejsze nieefektywne rozcieńczenie,
g) S20 - największa warto ć czynnika rozcieńczającego, dla którego stwierdza się 20 % efekt
stymulacji.
1.4. Wytyczne ogólne
1.4.1. Naczynia do hodowli i szkło laboratoryjne należy myć wodnym roztworem detergentu,
a następnie dokładnie płukać.
1.4.2. Używać statycznych, odnawialnych lub przepływowych metod. Zwykle, je li roztwór jest stabilny
(np. roztwór z małą ilo cią mikroorganizmów, wysokim stężeniem toksycznych metali lub małej
lotno ci), używa się testu statycznego. Jeżeli próbki są niestabilne, użyć odnawialnej (codziennie) lub
przepływowej metody.
1.5. Zasada metody
Oznaczenie fitotoksyczno ci na rzęsie wodnej Lemna minor polega na obserwacji reakcji organizmów
testowych umieszczonych w wyciągu wodnym badanych odpadów. W etapie pierwszym okre lanym
jako test wstępny ustalany jest rząd toksyczno ci wykorzystywany w etapie drugim zwanym testem
wła ciwym, na podstawie którego okre lane są warto ci następujących parametrów: NER5, NER50,
NER90, LID oraz warto ć S20.
1.6. Odczynniki i roztwory:
a) roztwór podstawowy A:
- NaNO3
- NaHNO3
- K2HPO4,
b) roztwór podstawowy B:
- CaCl2*2H2O
- MgCl2
- Na2EDTA*2H2O
- MnCl2,
c) roztwór podstawowy C:
- MgSO4*7H2O
- H3BO3
- Na2MoO4*2H2O
- ZnCl2
- CoCl2
- CuCl2,
d) woda demineralizowana lub destylowana,
e) wodny roztwór detergentu.
1.7. Aparatura i przyrządy:
a) urządzenia laboratoryjne do mieszania i rozcieńczania pożywki,
b) źródło wody demineralizowanej lub destylowanej,
c) autoklaw,
d) pH-metr,
e) ręczny obiektyw lub mikroskop selektywny,
f) akwaria hodowlane - 15 l naczynia (np. akwarium) lub nierdzewna stalowa miska,
g) lodówka,

14